목적
질병의 정확한 진단과 적절한 치료 그리고 이에 대한 연구를 위해서는 환자의 병소에서 채취한 검체물의 형태학적 소견을 관찰하는 것이 중요하다.
이러한 형태학적 변화를 관찰 하기 위해서, 연구자들은 생검조직으로 제작한 헤마톡실린-에오신 염색표본을 광학현미경 으로 관찰하여 정보를 얻고 있으며, 필요한 경우에는 전자현미경적 검색을 통하여 세포의 미세구조를 관찰하고 있다.
그러나 인체의 각종 질환은 점차 세분화되고 새로운 진단기준이 소개 되고 있으며, 종양의 진단에 도움을 주는 종양표지자 그리고 예후를 판정할 수 있는 예후인자들이 알려지고 있어서, 통상적인 헤마톡실린-에오신 염색표본이나 전자현미경적 검색만으로는 이러한 종합적인 정보를 얻기가 어렵다.
이러한 문제점들을 보완해 주는 검사 방법인 면역조직화학적 검사는 미분화 세포의 기원을 확인하거나 효소, 홀몬, 종양표지자 및 예후 인자의 존재유무, 그리고 암종과 육종의 구별 및 양성종양과 악성종양의 검별 등에 효율적으로 이용되고 있다.
면역조직화학적 염색은 조직검사 수기 중 민감성과 특이성 이 매우 높은 검사방법으로서 진단 및 연구 분야에 광범위하게 이용되고 있다.
최근 20 년간 이분야는 많은 발전을 이루어 결과의 판독을 신속히 할 수 있는 염색방법이 소개 되었으며, 파라핀 절편의 이용으로 후향적인 연구가 가능하게 되었고, 항원 의 검출을 위한 항체의 개발이 계속되어 수천가지 이상의 항체가 언제든지 실험에 이용할 수 있게 되었다.
따라서 임상의들의 면역조직화학적 염색의 원리와 판독요령에 대하여 이해 하고 있다면 다양한 항체들을 연구나 진단목적으로 활용하는데 많은 도움이 될 것으로 생각된다.
정의
면역조직화학이란, 항원 항체가 일으키는 반응에서 예민성과 특이성을 이용한 것으로 조직내의 단백질이 세포질내에 만들어지며 그 단백질에 대한 생성물질을 검출하는 염색법으로 일차항체를 결합시키고 그 항체에 대한 이차항체를 육안으로 찾아볼 수 있도록 하는 방법으로 면역그로브린, 호르몬, 효소 및 종양의 Maker 검출 등의 병리조직 분야와 진단에서 어느 부위가 단백 발현을 하는지를 현미경하에서 직접 눈으로 관찰하는 형태학적 검사이다.
장점
면역조직화학법은 발현조직의 부위 즉 형태(Morphology)를 밝힐 수 있는 방법으로 Western Blotting 방법이 발현 여부만을 알 수 있는 기술검사라면, 면역조직화학법은 조직의 어떤 부위에서 단백이 발현 되는가를 정확히 육안으로 관찰하는 일종의 분석검사하고 할 수 있다.

면역조직화학검사는 지금까지 형태학적인 소견만으로는 진단을 내리기 어려운 점을 보완해 주고 있으며, 형태학적 변화가 미세하거나 경계성 병변(borderline lesion)인 경우에 정확한 진단을 내릴 수 있도록 객관적인 정보를 제공하여 주고 있다.
연구자들은 세포나 조직에 존재하는 항원의 검출을 위한 일차항체의 개발을 위하여 노력을 계속하고 있으며 앞으로 보다 더 민감하고 특이성을 갖는 검사방법을 개발하고 있다.
따라서 면역조직화학적 검사는 임상의들이 진단 및 연구에 이용할 수 있는 간편하고 유익한 검사방법이 될것으로 생각된다.

검사의 원리
면역조직화학적 검사란 항원과 항체간의 반응을 이용하여 세포나 조직내에 존재하는 물질을 확인하는 면역염색법이다.
면역조직화학적 염색의 발전은 면역형광법의 개발로 활성화 되었다.
면역형광법은 형광색소를 부착시킨 항체를 조직절편에 부치시키고 완충액으로 세척하면 항원과 선택적으로 결합한 항체만 남게된다.
이러한 방법으로 염색한 조직절편을 형광현미경으로 관찰 하면 자외선에 의하여 형광색소가 형광을 나타내게 되므로 항원과 항체가 결합한 부위에서 양성반응을 확인할 수 있다.
그러나 면역형광법은 냉동조직절편을 사용해야 하고 분해능이 떨어지며 음성반응을 보이는 세포나 조직학적구조를 관찰할 수 없어서 진단 및 연구에 쉽게 이용하기는 어려웠다.
그 이후로 면역조직화합법의 효시가 된 과산화효소를 이용한 효소항체법이 최초로 개발되었고, PAP(Peroxidase Anti-Peroxidase)법이 개발되었다.

PAP법은 파라핀절편의 이용이 가능하고 염색 표본을 장기간 보존할 수 있게 되어 임상에서 광범위하게 이용되기 시작하였으며, 그후 Protein A법과 ABC (Avidin-Biotin Conjugae)법이 개발되었다.면역조직화학적 검사를 이용하여 검출하는 항원은 분자량이 5,000정도인 단백, 다당류, 핵산 등의 고분자 물질이다.
항원에는 항체를 식별하는 특정한 부위가 있는데, 이를 항원 결정부위 (epitope)라고 부르며 분자량 5,000에 대하여 한군데가 있는 것으로 알려져 있다.
즉, 분자량 이 20,000이면 4개 정도의 항원 결정부위가 있다.
항원에 결합하는 항체는 혈청내의 면역글로블린(Immunoglobulin, Ig)이라 부르는 단백질에 존재한다.
면역조직화학에 이용되는 일차항체는 IgG 분자이며 항원과의 결합부위를 갖는 Fab (antigen binding fragment)라 불리는 짧은사슬과 Fc(crystallizable fragment)라고 불리는 긴 사슬로 구성되어 있다.
일차항체(Primary Antibody)는 일반적으로 단 클론항체 (Monoclonal Antibody)와 다 클론항체(Polyclonal Antibody)로 구분된다.
항원의 분자량이 크면 항원 결정부위가 많아서 여러 종류의 항체를 생성할 수 있다.
이와 같이 한가지의 항원에 존재하는 다수의 항원 결정부위에 각각 결합할 수 있도록 여러 종류의 항체가 혼합된 항혈청을 다 클론항체라 한다.
이에 비하여 한군데의 항원 결정 부위와 결합할 수 있는 항체를 단 클론항체라 한다.
조직절편내에서 면역반응을 통하여 형성된 항원-항체 결합체는 항체가 면역글로블린이기 때문에 현미경을 이용한 관찰이 불가능하다.
따라서 어떤 표지물질을 항체에 부착하여 항원 항체 반응의 존재부위를 확인 할 수 있도록 해야한다.
이러한 표지물질은 형광색소와 Horse-Radish Peroxidase, Glucose Oxidase,
Alkaline Phosphatase 등의 효소가 이용된다.
표지물질로 이용하는 형광색소는 Fluorescein Isohiocyanate(FITC: 황녹색 형광)와 Tetrame-thylrhodamine isothiocyanate(TRITC: 적등색 형광)가 있다.
효소를 표지물질로 이용하는 방법은 형광색소나 방사성 동위원소에 비하여 여러 가지 장점을 갖고 있다.
즉, 효소의 반응이 반복되므로 민감성이 높고 방사성 동위원소와 같이 사용상의 규제와 특별한 시설을 필요로 하지 않으며, 형광물질이나 중금속은 형광현미경과 전자현미경적 검색에만 사용할 수 있지만 효소는 광학현미경과 전자현미경 모두를 사용할 수 있다.
양성반응을 관찰하기 위한 발색 과정은 부착시킨 효소의 종류에 따라 선택할 수 있다.
발색제는 Horse-Rradish Peroxidase를 부착시킨 검출계(detection system)를 이용한 경우 Diamino- benzidine(DAB),3-amino-9-ethylcarbazole (AEC)를, Glucose Oxidase는 Tetrazoilum을 alkaline phosphatase는 BCIP/NBT, BCIP/INT, New fuchsin,
Fast Red TR Salt 등을 사용 한다.
면역조직화학적 검사방법은 직접법(Direct Method) 과 간접법(Indirect Method)으로 크게 구분할 수 있으며 간접법은 표지물질을 결합시킨 항체를 사용하는 표지 항체법 (Lable Conjugate Antibody Method)과 비표지 항체법(Unlabelled Antibody Method)으로 구분된다.

직접법은 일차항체에 효소를 부착시켜서 염색에 이용하는 방법이다.
효소가 부착된 일차항체를 항원과 반응 시킨후 완충액으로 세척하면 항원에 결합된 항체만 남게된다.
이때 발색제를 첨가하면 항체에 부착된 효소에 의하여 양성반응이 관찰되므로 항원의 존재유무나 존재 부위를 확인할 수 있다.
간접법 가운데 가장 간단한 표지항체은 일차항체에는 효소를 부착하지 않고 일차항체의 Fc부분에 특성을 갖는 이차항체에 효소를 부착 하여 사용하는 방법이다.
이때 일차항체를 제조하는 동물과 이차항체를 제조하는 동물은 달 라야 한다.

비표지항체법은 일차 혹은 이차항체에 표지물질을 부착 시키지 않는 방법으로서 민감성이 매우 높은 방법이다.
여기에 해당되는 검사방법은 PAP법, ABC법 그리고, Protein A 법 등이 있다. 일반적으로 직접법은 비교적 간편하고 여러 단계를 거치는 간접법에 비해 비특이적인 염색소견이나 배경염색(Background Staining) 이 적다. 그러나 각각의 항체마다 효소 를 부착해야 되는 어려움이 있다.
이에 비하여 간접법은 각각의 항원에 대한 일차항체를 제 조한 동물이 동일한 경우에는 이차항체를 공통적으로 사용할 수 있고, 여러과정을 거치므로 서 반응의 강도를 증가시킬 수 있다.

간접법은 시간이 많이 소요되고 검사과정이 복잡하며, 비 특이적 반응이나 배경이 염색되는 단점이 있었으나 최근들어 자동 및 반자동 염색기의 개 발 과 시약의 개발 등으로 시간이 단축되었고 비특이적인 염색이 줄어들었다.

연구자들은 실험목적이나 선호도에 따라 염색방법을 선택하고 있는데, 병원이나 실험실에서 주로 사용되고 있는 면역조직학적 검사방법은 초기에는 PAP법이었으나 지금은 ABC법을 거쳐 LAB법이 활발하게 이용되고 있다.
검체의 종류 및 고정 처리
Paraffin Embedded Tissues, Frozen Tissues, Formalin Fixed Tissues, Cell Smear등의 것이 있으며 항원의 보존을 위하여 가능한 신선한 조직을 4℃에서 고정해야 한다.
이상적인 고정액은 인화성이 없고 인체에 무해하며 육안소견 및 현미경소견 나아가 분자병리학적인 검사에 도움이 되어야 한다. 통상적으로 이용되는 포르말린은 세포내 단백과 결합하는 교차 결합 고정액(Cross-Linking Fiaxtive)이므로 장시간 고정된 조직은 검색에 지장을 초래하고 항원 검출을 방해하므로 Formalin Free Fixative의 개발이 요구되고 있다.
검체의 준비
신선한 조직의 냉동 절편이나 고정액에 고정된 조직을 파라핀에 굳혀서 3-4micron으로 박절하여 silinated coating 된 slide 혹은 probe on plus slide에 붙여 놓는다.
냉동절편의 경우는 10% Formalin in PBS 에 10분간 고정하고 -20℃의 Methanol에서 3~5분 방치후 -20℃ 아세톤에서 1~3분 고정한후 PBS로 수세하여 조직을 준비하거나, -70℃의 냉동고에 보관하거나 즉시 이용한다.
파라핀조직에 굳힌 경우는 실험 하루 전에 박절후 약 56℃에서 40분간 부치시킨후 실온에서 보관하며 실험 시작 약 1시간 전에 56℃에서 20분간 부치시킨후 사용한다.
파라핀 조직을 염색하는 방법은 다음에 나오는 '염색시약 및 과정'을 참조한다.
단, 냉동절편의 경우는 파라핀 제거와 알콜의 수세과정 이후의 과정부터 시행하면 된다.
항원의 보존
일차항체가 냉동조직절편에서만 항원의 검출이 가능한 경우는 생검조직을 가능한 한 빨리 냉동시킨 후 냉동 조직절편을 제작하여 실험에 이용한다.
생검조직은 항원성의 보존을 위하여 통상적으로 포르말린에 고정한다.
포르말린은 단백질이나 펩타이드를 교차결합시키므로 형태학적 구조가 잘 유지되나 오랜시간 고정할 경우 항원성이 손상될 수가 있다.
알콜이나 아세톤 등은 단백질을 응고 침전하는 방법으로 고정시키므로 고분 자 단백질의 항원성이 잘 유지되고 세포내의 불용성 물질을 동정하는데 우수하지만 항원의 부동화가 불완전하고 조직의 수축이 강하다.
따라서 항원성의 보존을 위하여 적절한 고정액의 선택과 고정시간을 알맞게 해야한다.
최근에는 포르말린에 고정한 후 제작한 파라핀절편에서 통상적인 염색방법으로 항원의 검출이 어려운 경우에는 전자렌지(Microwave), 고압 멸균기(Autoclave), 압력솥(Pressure Cooker) 등을 이용한 antigen retrieval system을 이용하므로서 좋은성적을 얻고 있다.