과산화효소에 대한 항체를 만들고, 이 항체와 과산화효소를 면역학적으로 결합시켜 형성된 면역 복합체인 PAP를
사용하는 방법이다.
이 방법은 먼저 표본내의 항원을 일차항체 및 이차 항체와 반응시킨 후에 일차항체와 같은 동물에서 만든 PAP를
이차항체와 결합시켜 양성 반응을 관찰하는 것이다.
PAP법은 하나의 항원-항체 반응물에 3개의 과산화효소가 결합되어 있어서 면역반응물을 확인하는데 민감성이 증가된다.
2) ABC 법
1981년도에 처음 소개 되었으며, ABC법은 당단백인 Avidin이 저분자량 비타민인 Biotin에
친화력이 매우 강한 원리를 이용 한 방법이다.
Avidin은 계란 흰자위에 존재하는 당단백으로서 4개의 Biotin과 결합할 수 있는 입체구조를 갖고
있다.
Biotin(Vitamin-H)은 쉽게 항체의 Fc부분에 부착되므로 이차항체에 부착시켜서 사용하고 있다(Biotinylated
Antibody).
ABC방법의 처리과정은 먼저 일차항체를 조직면에 존재하는 항원에 결합 시킨 후 Biotin이 부착된 이차항체(Biotinylated
Antibody)를 반응시킨다.
그리고 Avidin과 효소가 부착된 검출계 (Avidin/Biotinylated Enzyme)를 이차항체에
부착된 Biotin과 결합하게 한다.
이 방법은 하나의 항원에 여러개의 효소가 부착될 수 있으므로 민감도가 매우 높은 방법이며 현재 가장 많이
이용하고 있는 방법이다
이 방법에 사용되는 Avidin에는 탄수화물이 존재하여 Lectin과 같은 물질 에 친화력을 나타내므로
비특이적인 결합을 할 수 있다.
3) LAB 법
1987년에 미국의 Zymed사에 의하여 처음으로
상업화된 염색 KIT로 Labled (strep)Avidin-Biotin 방법으로 기존 ABC KIT
보다 더욱 민감하고, 빠르고, 깨끗한 효과를 얻을 수 있고 검사 단계를 줄일 수 있는 방법으로 현재
가장 많이 상용화하고 있다.
LAB법은 Affinity Purified된 이차항체를 사용하며 Strepavidin에 Biotinylated된
Enzyme을 사용하지 않고 Strepavidin에 Enzyme을 직접 부착시켜서 사용하고 있다.
Strepavidin이란 Streptomyces Avidinii라는 세균의 배양액으로부터 추출되는
Avidin과 유사한 특성을 갖고 있으면서 탄수화물을 포함하고 있지 않기 때문 에 Avidin의
결점을 보완할 수 있다.
최근에는 검출계에 Avidin 대신하여 Streptavdin을 부착시켜 염색에 이용하고 있다.
4) NBA 법
NBA 검출방법은 1999년 미국의 Zymed사에서
개발된 새로운 염색법으로 Non-Biotin Amplification kit로 Biotin, Avidin
혹은 Strepavidin의 부착없이 일차항체의 Chromogenic Visualization (발색구현)을
실현시킨 획기적인 방법으로 조직과 세포내에 내재된 Biotin 검출을 원천적으로 차단시켜 고질적인
배경염색을 없앨 수 있는 유일한 방법으로 차세대 염색을 주도할 상품으로 여겨진다
FITC-Conjugated된 이차항체에 HRP가 혼합된 Anti-FITC와 결합시켜 기존의 ABC
법과 LAB 법의 Biotin과 Enzyme을 배제 시켰다.
HIER Methods를(Heat Induced Epitope Retrieval) 사용하는 항원
검사에 특히 좋다.
검사의 방법
