면역조직화학적 염색이 끝난 슬라이드는 대조염색을 시행한 후 현미경을 이용하여 결과를 판독하게 된다.

판독을 할 때 가능하면 헤마톡실린-에오신 염색표본을 함께 비교하면서 결과를 판정하는 것이 좋다.
양성반응은 발색제의 종류에 따라 갈색, 적갈색, 적색, 흑색 등으로 나타나며 주로 헤마톡실린으로 대조염색을 시행하므로 청색과 대조가 되어서 쉽게 판정 할 수 있다.

조직절편의 중앙부에 비하여 주변부가 강하게 염색되었을 때는 비특이적 염색(edge artefact)으로 처리한다.
일차항체에 대한 양성세포가 종양세포인지 비종양세포인지 판정해야 하며 양성반응의 강도를 음성반응을 나타내는 세포나 조직과 비교해야 한다. 양성반응이 매우 약하게 관찰될 경우는 결과의 판정을 주의해서 해야 하다.
즉 전반적으로 배경 염색이 되어 있으면서 약한 양성반응을 보였다면 양성으로 판정해서는 안된다.
동일한 질환으로 진단된 파라핀 절편들을 대상으로 하여 한가지 항원의 발현양상을 관찰할 경우에는 상호간의 염색강도를 비교할 필요가 있다.

이때에는 동일한 조건하에서 염색을 시행한후에 염색강도에 따라 등급을 정할 수 있다.
면역조직화학 적 염색 결과를 판정할 경우에 가장 주의해야 할 점은 위양성과 위음성이다.
이러한 가능성을 줄이기 위하여 헤마톡실린-에오신 염색표본의 조직소견과 환자의 임상진단이나 증상을 참조하는 것이 도움이 된다.
염색결과를 판정하면서 위양성과 위음성인 경우들을 먼저 확인하는 것이 중요하며 실험을 시행하는 연구원은 이러한 결과가 나타나지 않도록 주의를 기울여서 염색을 시행하여야 한다.

면역조직화학적 염색상 위음성이 나타날 수 있는 경우들은 다음과 같다. ( ＋ → － )

(1) 생검조직의 부적절한 고정에 의한 항원성의 소실

(2) 냉동조직절편에만 이용이 가능한 일차항체를 파라핀 절편에 사용

(3) 일차항체와 결합능이 없는 이차항체의 사용

(4) 내재성 효소를 억제할 목적으로 사용하는 억제용액을 검출계 다음과정에 사용

(5) 검출계에 부착된 효소와 발색제의 불일치

(6) 유효기간이 지난 항체나 시약의 사용

(7) 포르말린에 고정한 후 제작한 파라핀 절편에서 Cytokeratin, EMA, Factor VIII 등에 대한 염색시 단백분해효소로 전처치를 하지 않은 경우

(8) 탈회과정을 거친후 제작된 파라핀 절편

(9) 항원을 복원시키는 전처리가 부적절 하였을 경우

면역조직화학적 염색상 위양성이 나타날 수 있는 경우들은 다음과 같다. ( － →＋ )

(1) 농도가 높은 일차항체의 사용

(2) 완충액을 이용한 세척과정이 불충분한 경우

(3) 내재성 효소를 억제시키지 않고 염색을 시행한 경우

(4) ABC법에서 biotin이 내재된 조직(신장, 간장, 췌장조직) 등을 염색하는 경우

이와같이 면역조직화학적 검사도 임상검사와 마찬가지로 위양성과 위음성이 관찰될 수 있으므로 정도관리 (Qulity Control)를 실시해야 한다. 이를 위하여 염색을 시행하면서 음성대조와 양성대조 실험을 함께 실시하는 것이 좋다.

1) 음성대조법(Negative Control)

면역조직화학적 염색을 시행함에 있어서 다음과 같은 음성대조법을 시행한다.

(1) 일차항체에 결합하는 항원물질을 과량 첨가함으로서 항체활성을 완전히 억제시킨 항체액으로 염색을 시행한다.

(2) 일차항체 대신 동종 동물의 면역활성이 없는 정상혈청이나 일차 항체 희석액을 이용한다.

(3) 일차항체에 대한 항원이 존재하지 않는 조직이나 장기의 절편을 염색에 이용한다.

2) 양성대조법(Positive Control)

일차항체에 대한 항원의 존재를 알고 있는 조직절편을 이용하여 염색을 한 다음 양성반응을 확인하는 방법이다.
양성대조 조직절편(postitive control tissue section) 은 면역조직화학적검사에 있어서 가장 중요하다.
가능하면 각각의 실험실에 양성대조 조직절편을 충분히 보유하도록 하여,염색을 시행 할 때마다 함께 실시하여 양성 반응을 확인하는것이 좋다.(Sausage :각각의 양성조직을 하나로 제작한 Block)

참조 사항

면역 조직 화학적 검사의 원리와 판독 요령을 이해하고 나서 다음의 사항을 참조 한다면 양질의 검사 성적을 얻을 수 있을 것이다.

1) 일차항체의 올바른 선택

일반적으로 다 클론항체는 교차반응성이 높아 위양성이 나타나기 쉬워 특이성이 낮다고 생각하고, 단 클론 항체는 특이성이 높다고 판단할 수 있으나 단 클론항체도 교차반응을 나타낼 수 있고 항원결정 부위가 감추어지는 경우에는 위음성을 나타낼수 있기 때문에 검출하려고 하는 항원에 따라 적절한 항체를 선택해야 한다.

일차항체는 여러 가지 종류의 항체가 시판되고 있지만 효소면역검정(Enzyme ImmunoAssay)용, Western Blotting용, 면역형광용, Flowcytometery용 등으로 제조된 항체도 있으므로 상품화된 항체의 적용서를 잘살핀후 각각의 실험 목적에 맞는 일차항체를 구입하여야 한다.
또한 일차항체가 희석된 항체인지 혹은 농축형태 인지를 반드시 확인하고 농축형태인 경우에는 단위가 함량(mg)인지 용량(ml)인지를 확인하여야 하며, 또한 액체(Liquid)상태인지 혹은 동결건조(Lyophilized)된 상태인지를 잘 펴야된다.
일반적인 일차항체는 방부제 의 일종인 Sodium Azide등이 함유되어 있으나 연구목적에 따라 Azide free된 상품이나 Bovine Serum Albumin free된 상품을 선택할 경우도 있음을 염두해 두어야 한다.

2) 배경염색(Back Ground)의 원인

IHC염색의 가장 중요한 요인의 하나인 지저분한 배경염색을 일으키는 요인은 일반적으로 적정시간의 경과(over time)에 따른 과염색에 기인한다. 따라서 전체적인 염색과정에서 본다면 시간 보다는 농도를 높이는 것이 바람직하다.
일차항체와 검출계의 경우가 이에 속한다.
특히 검출계(Streptavin-HRP)의 경우는 특별하여, 가능한 고농도와 민감성이 높은 제품의 사용으로 반응시간을 짧게 하므로 좋은 결과를 가져올 수 있다. 따라서 시간이 많이 주워지는 염색의 경우에는 반드시 4℃ (Ice bath)에서의 반응조건이 필요하다.
다음의 요인으로는 각각의 조건에 맞는(Buffer or D.W.) 수세과정에 있어서의 적절한 조치가 요구된다.
또다른 요인인 발색시약 반응의 경우는 위와는 반대로 농도보다는 시간의 경과에 유념하여야 한다.
짧은 시간 안에 반응하는 민감한 상품보다는 시간의 경과에 따라 서서히 반응하는 상품이 지저분한 배경염색을 예방하는데 좋은 효과를 가져올 수 있다.

3) 기타 참조사항

1. 항체가 유사한 단백과 교차반응을 할 경우 측정 하고저 하는 단백이 아닌 다른 단백이 검출될 수도 있다.
또한 스테로이드 홀몬의 경우 아직 정확한 고정법이 없으므로 염색된 부분이 전체라고 판단하는 생각은 버려야 한다.

2. 조직의 특성과 장기의 종류에 따라 각각의 내재된 Enzyme 또는 Biotin의 정도가 각기 다르므로 Auto Blocker시약 처리시간을 알맞게 조정 해야한다.
특히 Liver같은 장기조직은 Strep-HRP보다 Strep-AP를 부착시킨 검출계를 사용하는것도 바람직 하다.

3. 이차항체와 Streptavidin과의 결합 이후의 증류수 세척은 비특이적인 결합으로 인하여 발생되는 불완전한 결합을 상실케하여 지저분한 배경을 방지하게 한다.

4. 증명할 물질구조의 불안정과 고정액의 가열에의한 결합력 상실 등의 경우로 간단히 해당물질의 존재여부를 판단하여서는 안된다.

검사의 응용

종양세포의 기원을 증명하기 위해 사용되는 항체는 세포의골격(Cytoskeleton)을 구성하는 5가지 종류의 중간세사(Intermediated Filament)에 대한 일차항체가 사용되고 있다.
중간세사란 세포의 모양과 형태유지 그리고 세포질과 세포의 운동에 관여하는 세포골격(Cytoskeleton)성분 가운데, 직경이 중간크기(10nm)를 나타내는 구조단백질을 말한다.

2) Vimentin Vimentin은 주로 간엽세포(Mesenchymal Cell)에서 발견되는 중간세사로서 파라핀 절편에서 잘 증명된다.

3) Desmin Desmin은 평활근과 골격근 그리고 심장근의 Z선에서 검출되며 평활근육종(Leiomyosarcoma)의 진단에 유용하게 이용된다.

4) Glial Fibrillary Acidic Protein(GFAP) GFAP는 성상세포(Astrocyte)에 존재하는 독특한 중간세사로 신경원, 근세포, 상피 등에서는 발견되지 않는다.

5) Neurofilament Neurofilament신경세사는 분자량이 큰 폴리펩타이드이며 대부분의 신경원(Neuron)에 분포하고 있다.

이외의 세포의 기원을 확인하기 위해 사용되는 항체는 EMA, LCA, S-100 등이 있으며, 도표에 나타난 Primary Screening Pannel을 참조하면 검사에 많은 도움을 가질 수 있다.

Leukocyte Common Antigen(LCA, CD45) LCA는 림프구 및 조혈계 세포와 그 전구세포 의 막에서 관찰되며 조혈계 종양(hemo-poetic tumors)의 약 90% 이상이 양성으로 염색된다.

S-100 protein S-100 단백은 분자량이 약 21KD인 산성단백질로 발생학적으로 신경외배엽(neuroectoderm)에서 유래한 조직에 분포한다. 주로 멜라닌 세포성 종양이나 말초신경 종양의 진단에 유용한 것으로 인정되고 있다.

그밖에 인체 감염을 유발하는 미생물에는 박테리아, 진균, 기생충, 바이러스 등에 대한 항체가 개발되어 혈청학적 검사나 배양 후 동정한 결과에만 의존하여 오던 임상의들에게 면역조직화학적 검사는 좀 더 특이성을 갖는 방법이 되었다. 최근에는 면역기능이 억제된 환자에 서 이차 감염이 증가됨에 따라 검체물을 이용한 면역조직화학 검사가 많은 도움이 되고 있다. 지금까지 실험실에서 이용이 가능한 일차항체는 다음과 같다.

Escherichia coli, Helicobacter pylori, Mycobacterium bovis, Candida
albicans, Cryptococcus neoformans, Pneumocystis carinii Toxoplasma
gondii, Enterovirus, Epstein-Barr virus, Hepatitis B virus surface antigen,
Hepatitis B virus core antigen, Herpes simplex virus I, Herpes simplex
irus II,Human Immunodeficiency virus, Human papillomavirus,Rotavirus.

1) Micro Wave를 이용한 처리방법

1. Citrate Buffer (ZYMED: 00-5000)을 20배 D.W로 희석시킨다.
( 0.01M CITRATE BUFFER, PH 6.0 )

2. 탈 파라핀 처리한 조직을 10분간 3%H2O2 In Absolute Methanol 용액에 처리 한다.

3. 각각 2분간 3번씩 증류수에 세척한다.

4. Citrate Buffer에를 코프린자에 넣고 전자렌지에서 약10분간(끓기전)Warming 한다.

5. Citrate Buffer에 SLIDE를 담근다음 전자렌지에 90℃-100℃이하로 10분간 가열한다. 이때 Buffer의 증발로 인한 조직의 노출을 방지하기 위하여 5분간 2회 또는 3회로 나눠 증발한 분량만큼을 보충하고 다시 가열한다.

5. 코프린자를 전자렌지에서 꺼내서 조직을 담근채로 실온에서 20분간 방치한다.

6. Tris Buffer로 Slide를 충분히 씻어내고 IMMUNOSTAING 염색순서에 따라 실험을 진행한다.

주위 : 반드시 Slide는 Poly L-lysine (ZYMED :00-8050)으로 처리된 Slide나 Positive Charged된 X-tra Slide를 사용한다. 높은 온도에 인한 Buffer의 증발로 조직이 노출되지 않아야 한다.
Buffer 반드시 PH가 6.0 이어야 한다.

2) Auto Clave를 이용한 처리방법

1. 상기와 같이 1.2.3.의 경우와 마찬가지로 동일하게 처리한다.

2. Citrate Buffer가 담긴 코프린자를 Autoclave넣고 121℃에서 10분간 Warming한다.

3. Buffer에 Slide를 넣고 15분간 처리한다.

4. 실온에서 20분간 식혀둔다

5. Tris Buffer로 Slide를 충분히 세척하고 다음순서에 따라 실험을 계속한다.

3) Pressure Cooker를 이용한 처리방법

1. 상기와 같이 1.2.3.의 경우와 마찬가지로 동일하게 처리한다.

2. 압력솥에 물을 2/3 가량 채운후(뚜껑을 꽉 닫지않은 상태) Coplin jar안의 Citrate Buffer를 약 5분간 끓지않을 정도로 Warming한다.

3. Warming한 Citrate Buffer에 Slide를 넣고 압력이 채워져 추가 흔들리기 시작할 때부터 약 10분간 끓여준다. (압력이 높은 상품일수록 효가가 증대)

4. 다 끓인 압력솥에서 압력이 빠지면 Slide가 담긴 Coplin jar를 꺼내 실온에서 20분간 식혀둔다.

5. Tris Buffer로 세척후 다음순서에 따라 실험을 계속한다.

T.U.F.란 Target Unmasking Fluid라는 Buffer로 기존 상품화된 Citrate Buffer를 사용하기 이전에 상용화된 네덜란드의 Kreatech사의 상품으로 Citrate Buffer외에 Methanol과 Rinse solution을 배합하여 만든 상품으로 Citrate Buffer와 다른점은 Frozen Tissues도 사용 가능하고 모든 Paraffin 조직에 적용이 가능하 것이 특징이며, Antigen Retrieval과 더불어 기존 Primary Antibodies의 희석배율을 높혀 사용할 수 있다.

4) T.U.F.를 이용한 ANTIGEN RETRIEVAL PROTOCOL.

1. T.U.F. 250ml을 Coplin jar에 약 210ml(TUF70ml : D.W.140ml)만을 준비하여 둔다.

2. 탈 파라핀 하고 알콜에 수세한 조직을 TUF속에 충분히 담근다.

3. Coplin jar를 다음과 같은 방법중 택일하여 사용한다.

가) 90℃로 온도를 조절할 수 있는 기기를 사용할 때.
A. Water Bath를 사용 Coplin Jar를 수조에 넣어 90℃에서 10분간 Incubate한다.
B. Dry Oven 혹은 Incubator 에서 T.U.F가 담긴 Coplin Jar를 90℃에서 10분간 Incubate 한다.

나) 90℃로 온도조절을 할 수 있는 기기를 사용할 수 없을 때.
A. Micro Wave 혹은 저기 곤로를 사용할 때는 상기의 Micro Wave를 이용한 처리방법과 동일하다.
이때 주의할 사항은 조직이 SLIDE 에서 이탈을 방지하기 위하여는Oganosilane Coated된 Slide나 Positive Ion을 가진 X-tra Slide를 사용해야 한다.
B. T.U.F가 끓을때 시약의 넘침을 막기 위하여 그릇내의 시약의 용량을 적절히 조절해야하고 비닐 lap등을 이용하기도 한다.

다) MICRO PROBE를 사용할 때.
A. TUF 150UL를 Isolon 2칸을 준비한다.
B. TUF를 채우고 100℃에서 5분간 Incubate한다.
C. 고온처리 이므로 조직의 건조한 상태를 주의깊게 관찰하면서 다른 Isolon에 준비된 TUF를 B와 같이 다시 한 번 반복한다.

4. 실온에서 약 20분간 방치한다. (TUF에 담겨진 상태)

5. Tris Buffer에서 충분히 세척한다.

6. 정상적인 IMMUNOHISTOCHEMICAL STAINING의 STEP을 수행한다.

T.U.F 사용시 주의사항

1) 원칙적으로 TUF 처리는 Antigen을 Preperation하는데 필요한 조치로서 Paraffin이나 Frozen Tissues 의 모든 Antibodies에 적용가능하며 특히 Oncoprotein과 Nuclear Protein에서 좋은 효과를 얻을 수 있다.

2) 조직의 건조한 상태만을 방지하고 끓어 넘침을 방지할 수만 있으면 TUF처리 온도는 높으면 높을 수록 효과가 크다.

3) 3배 농축액으로 제조된 TUF의 효율적 사용방법은 한번에 모든용액을 희석사용 하지말고, Coplin jar를 채울 분량만을 우선 희석사용하고 일정량의 TUF원액을 (약 5ml)을 희석액에 첨가하며 사용하는 방법이 바람직하다.

단, MICRO PROBE사용할 때는 한 번에 일정량 (2 X 150ul)만 사용하면 된다.