염색시약 및 과정
STEP 1. AUTO DEWAXER :
Praffin으로 처리된 조직의 파라핀을 제거하는 시약으로 흔히 유기용매인 Xylene을 사용한다. 최근에는
인체에 무해하고 IHC 염색시 염색성이 뛰어난 Formalin free인 Histochoice Clearing
Agent 혹은 Dewaxing Solution을 사용하면 탈 파라핀 효과가 증대되며, 인화성이 없어 안전하다.
STEP2. AUTO ALCOHOL : 조직내의
Dewaxing Solution을 제거하고 조직절편의 함수를 목적으로 2 회 반복하여 Alcohol로 처리한다.
STEP3. B. IODINE : 거의
모든 고정액은 중금속을 함유하고 있다. 그러므로 조직내의 항원의 검 출반응을 떨어뜨린다. Formalin이나
B5등의 고정액으로부터의 Zenker Crystal를 제거하기 위하여 사용하며. Mecury를 제거하는
Lugol's Iodine과 Iodine을 제거하는 5%용액 Tiosulfate 를 사용해 왔으며, B.
IODINE은 이같은 조직표면의 금속물질을 한번에 제거하여 염색효과를 증대 시킨다.(근래에 와서는 이과정은
생략함)
STEP4. PEPSIN SOLUTION : 조직내의
항원이 Formalin의 고정액으로부터 잘 노출 될 수 있도록 조직절편을 단백분해효소인 FICIN, TRYPIN,
PEPSIN 을 이용하여 처리한다. 그러나 분해능력은 고정조건과 항원의 종류에 따라 각각 다르므로 전처리
용액은 정도에 따라 약산성, 중산성, 강산성으로 대신해 왔으나 근래에는 Pepsin(강산분해효소)으로 일괄
사용하며, 시간으로 정도를 가늠하고 있다. EMA, Cytokeratin, Collagen Ⅳ, FactorⅧ
Ag, Testosterone 등의 염색에 효과적이다.
STEP5. AUTO BLOCKER : Biotinlayed된
Secondary Antibody에Strepavidin만을 반응시키기 위해 조직내에 존재하는 Enzyme중
HRP와 Avidin을 억제 하기 위하여 사 용 한다. 흔히 3%용액의 과산화수소를 사용하여 내재되어 있는
Peroxidase를 억제 시키고 있으나 이과정의 효과에 따라 배경염색의 결과에 영향을 가져온다. 특히
이과정 이후의 수세과정은 특별해야 하며, 근래에는 수세효과를 증대시키는 Methanol과 린스가 함유된
Auto Blocker는 짧은 시간안에 내재되어 있는 Proxidase를 억제시키는데 탁월한 효과가 있다.
STEP5. IMMUNO/DNA BUFFER :
Washing Buffer로는 흔히 PBS와 Tris Buffer를 사용하는데 염색의 깨끗한 결과를 위하여는
올바른 Buffer의 선택이 중요하다. PH7.4의 완충액은 나름대로 제조와 사용에 약간의 차이는 있겠으나,
일반적으로 Tris Buffer가 PBS보다 검출에 더욱 더 민감하게 작용하며, Back Ground 염색을
줄여주는 세척액으로 효과가 크다. 10X Immuno/DNA Buffer는 증류수로 10배 의 용량으로
희석하여 사용하는 Tris Buffer로서 Methanol과 린스가 함유되어 Immunostaining
과 In Situ의 염색에 공히 사용하는 완충액으로 세척력이 탁월하다.
STEP6. PROTEIN BLOCKER : 일차항체와
일차항체의 Animal Source가 같은 이차항체의 면역글로블린과의 반응에 앞서 이차항체의 면역글로부린의
조직내 비특이적인 결합을 억제하기 위해 Primary Antibody를 반응 시키기 전에 사용하며 통상
10%의 표준혈청을 사용한다. Goat, Rabbit, Mouse등을 사용하며 혼합혈청을 사용하기도 한다.
STEP7. PRIMARY ANTIBODY : 일차
항체로는 Monoclonal과 Polyclonal Antibodies가 있고 농축형태와 희석형태가 있으며
농축항체는 냉동건조된것과 액체로 된 것이 있다. 통상 단위는 함량(mg)과 용량(ml)으로 구분된다. 상품화된
희석항체시약의 적정 농도는 제조회사의 사정에 따라 약간의 차이는 있으나, 일반적으로 Normal Cotrol
Tissue로 약 1시간 Incubate하여 염색되는 정도가 기준이 되어 만들어 진다. Pre-Diluted
Form의 일차항체의 Test수는 가로 세로 각1㎠의 크기의 조직에 적용되는 약 100㎕의 용량을 1 Test로
정한 것이다.
STEP8. UNIVERSAL SECONDARY ANTIBODY
: 이차 항체는Immunoglobulin에 Biotin을 Label 시켜서 제조하며
일차항체와 Animal Source가 같은 항체에서 만들어진것 이라야 상호반응을 일으킨다. 최근에는 일차항체와
같은 모든 동물의 혈청을 혼합하여 복합 이차항체를 제조하여 시간과 시약사용의 효율성을 높히게 되었으며,
복합 이차항체는 서로 다른 동물의 혈청이 상호 간섭작용을 일으키지를 않으므로 안심하고 사용할 수 있다.
실험동물의 경우에는 복합항체가 배경염색에 영향을 가져온다.
STEP9. STREPAVIDIN-HRP :
Biotin과 Avidin의 강한 결합력을 이용하여 Enzyme(HRP) 이 부착된 Avidin을 사용한다.
최근에는 Avidin보다 결합력이 강하고 Lectin과 친화력이 없는 StreptAvidin-HRP를 부착하여
염색효과를 높힐 수 있다. 일반적으로 Streptavidin의 반응 시간과 농도는 배경염색에 중요한 요인으로
작용을 하므로 적절한 반응이 요구된다. 제조사마다 각기 다른 조건을 가지고 있으므로 사전에 충분한 검토가
필요하다. 최근에는 민감성이 뛰어난 고농도의 상품이 개발되어 짧은시간(5-7분) 안에 반응이 나타나므로
지저분한 배경염색을 미연에 방지할 수 있게 되었다.
STEP10. SINGLE AEC OR DAB : Chromogen은
HRP에 반응하는 3-Amino-9-Ethylcarbazole(AEC)와 Diaminobenzidine(DAB)가
있다. AEC는 적갈색이며 DAB는 갈색으로 발색된다. 두가지 모두 3%Peroxidase를 이용하여 사용시마다
제조하는 번거로움이 있다. 또한 Carcinogen을 함유하고 있어 취급시 주위를 요하나 최근에는 이 미
첨가 희석되어 Single Solution으로된 역가가 안정된 상품이 개발되어 있어 취급과 사용이 간편한
제품이 상품화 되었다. 상품은 서서히 반응하는 것이 좋다.
STEP11. AUTO HEMATOXYLIN : Counter
Stain을 시행하여 염색된 양성반응을 확인하는 대조염색으로는 주로 Hematoxylin을 사용한다. Mayer보다
Harris가 면역조직화학 염색에 효과적이며, 근래에는
|
